Figueroa Lilian E.¹; Brugnoni Lorena I.^2,3; Dello Staffolo Marina.^1,4; Genovese Diego B.^1,5*

¹Planta Piloto de Ingeniería Química (PLAPIQUI) – CONICET – Universidad Nacional del Sur – Bahía Blanca, Argentina.

²Instituto de Ciencias Biológicas y Biomédicas del Sur (INBIOSUR).

CONICET – Universidad Nacional del Sur – Bahía Blanca, Argentina.

³Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia – Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca, Argentina.

⁴Departamento de Ingeniería Química – Facultad de Ingeniería – Universidad Nacional de la Plata. La Plata, Argentina. 

⁵Departamento de Ingeniería – QuímicaUniversidad Nacional del Sur. Bahía Blanca, Argentina.

*dgenovese@plapiqui.edu.ar

Resumen

El objetivo fue desarrollar un dulce de leche (DL) enriquecido con inulina (I), maltodextrina (M) y probióticos (P) encapsulados (-e) y sin encapsular (-se) a fin de estudiar la viabilidad de los probióticos, y evaluar el efecto de la presencia de fibras y probióticos sobre la aceptabilidad global del DL. El DL fue elaborado por el método de cocción-concentración, a partir de la mezcla de leche (80% reducida en lactosa y 1% de tenor graso), sacarosa, glucosa, bicarbonato de sodio y aromatizante artificial de vainilla. Las fibras dietarias fueron agregadas durante la etapa de concentración, 3g/100 g de producto final, para que el mismo pueda ser declarado “fuente de fibra” según el Código Alimentario Argentino. Las muestras ensayadas fueron: DLP-se, DLP-e, DLIMP-se y DLIMP-e. La cepa probiótica utilizada fue Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103). Las cápsulas se obtuvieron mediante extrusión mezclando una solución estéril de pectina de bajo metoxilo al 2% (p/v) con una concentración »10¹² células/ml, en relación 1/10. La mezcla se goteó en solución estéril de CaCl2 0,15 M, obteniéndose cápsulas ≤3 mm. Las células libres se prepararon a partir de un cultivo de 24 h del probiótico y el mismo, tanto libre como encapsulado, se agregó después del proceso de cocción-concentración del DL, luego de que se enfriara por debajo de 40°C, en proporción 1/100, tal que el producto final contenga un número inicial de aproximadamente 10⁹ cél/g. Las muestras se almacenaron durante 180 días a 4°C. La viabilidad bacteriana se determinó mediante recuento en placa en agar MRS quincenalmente y, al final del ensayo, se evaluó la supervivencia del probiótico en condiciones de simulación del sistema digestivo. El análisis sensorial se realizó con un total de 100 panelistas no entrenados (consumidores) a quienes se les pidió que determinaran la aceptabilidad global de cada muestra en una escala hedónica estructurada de 9 puntos. Los resultados de viabilidad al final del almacenamiento fueron de 3,4×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁷ y 2×10⁷ UFC/g en DLP-se, DLIMP-se, DLP-e y DLIMP-e, respectivamente. Luego de la simulación del pasaje por el tracto gastrointestinal (TGI), la viabilidad disminuyó hasta 3×10⁵, 9×10⁵, 1,5×10⁶ y 1×10⁷ UFC/g en DLP-se, DLIMP-se, DLP-e y DLIMP-e, respectivamente. Para asegurar los beneficios del consumo de probióticos, se sugiere que un mínimo de 6-7log UFC/g debe alcanzar el colon, por lo que podemos concluir que la encapsulación de L. rhamnosus con pectina es un método eficaz para mejorar su viabilidad en el TGI. Finalmente, el análisis sensorial demostró que la presencia de fibra no tuvo efecto significativo sobre la aceptabilidad, mientras que la encapsulación de los probióticos la redujo. Cabe resaltar que todos los puntajes promedio estuvieron por encima de los 5 puntos, en el orden: DLIMP-se (7,1) > DLP-se (6,9) > DLP-e (6,7) > DLIMP-e (6,1), por lo que se puede concluir que todas las muestras tuvieron una buena aceptabilidad.

Introducción

Existe un creciente interés por consumir alimentos saludables o funcionales (Shori y col., 2019). Los alimentos funcionales son aquellos que, además de sus nutrientes tradicionales (carbohidratos, proteínas, lípidos, minerales y vitaminas), contienen ciertos ingredientes que le aportan un beneficio extra a la salud del consumidor. Entre los ingredientes funcionales más reconocidos se encuentran las fibras dietéticas y los probióticos. La característica básica de la fibra dietética es que no es digerida por las secreciones gastrointestinales ni absorbida en el intestino delgado, mientras que sí es fermentada por la microbiota del intestino grueso. Se considera recomendable una ingesta de fibra de entre 25 y 30 g/día (García y col., 2018). Esta cantidad no se alcanza en la dieta de la mayoría de las poblaciones en la actualidad, por lo cual resulta interesante el desarrollo de alimentos que la contengan.

La inulina es un fructano lineal no digerible que está presente en las plantas. Debido a su bajo aporte calórico, es ampliamente utilizada en la industria alimentaria como sustituto de grasas y azúcares (Shoaib y col., 2016). Como prebiótico, la inulina puede promover selectivamente el crecimiento de probióticos e inhibir la proliferación de bacterias patógenas (Wang y col.,2020).

Por otro lado, la maltodextrina es un hidrato de carbono totalmente soluble en agua, de baja densidad aparente y baja viscosidad. La maltodextrina es digerible, y sólo mediante modificación química puede tornarse indigerible. Es un polvo incoloro e insípido, estable al calor, a la congelación y a los ácidos, por lo que es adecuado para una amplia variedad de aplicaciones alimentarias.

Finalmente, los probióticos pueden ser definidos como microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del consumidor (FAO/WHO, 2006; Hill y col., 2014). Por factores como la edad, la dieta, el ambiente, el estrés y la medicación, se produce un desequilibrio que implica perturbación del estado de simbiosis de la microbiota colónica llamado disbiosis, y se reconoce por cambios cualitativos y/o cuantitativos en su composición y funciones. Por esta razón, los probióticos son agregados a los alimentos con el fin de conservar y aumentar la microbiota del intestino de manera de producir efectos beneficiosos a la salud de quien los consume. Se utilizan habitualmente en alimentos lácteos, principalmente yogur y leche fermentada, debido a su capacidad para garantizar su supervivencia durante el almacenamiento y las condiciones gástricas sin afectar sustancialmente la calidad de los productos (Nyanzi y col., 2021). Según el Código Alimentario Argentino (CAA), el producto final debe contener un número de células viables entre 10⁶ y 10⁹ UFC/g, de manera que pueda ser rotulado “con probióticos”. En general, se acepta que los efectos beneficiosos se logran cuando una dosis mínima terapéutica de 10⁶-10⁷ UFC/g o ml alcanza el colon (Hill y col., 2014).

La viabilidad de los probióticos en los productos alimenticios es afectada por muchos aspectos intrínsecos y extrínsecos tales como oxígeno, aw, pH, temperatura de almacenamiento y condiciones de procesamiento (Mousavi y col., 2019). A fin de proteger a los probióticos en la matriz alimentaria durante el almacenamiento y el pasaje por el tracto gastrointestinal, y asegurar su llegada al sitio de acción para ejercer sus efectos beneficiosos sobre la salud, una de las estrategias más adecuada es la encapsulación (Arepally y Goswami, 2019).

El probiótico empleado en este trabajo, Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103), se ha utilizado con éxito en formulaciones alimentarias funcionales y sus efectos beneficiosos para la salud están bien documentados. Sin embargo, L. rhamnosus GG no se ha estudiado en la formulación de dulce de leche y su viabilidad en esta matriz alimentaria aún no se ha analizado. En la industria alimentaria tanto la inulina, la maltodextrina, la pectina y los probióticos que se utilizarán en este trabajo son aceptados como sustancias GRAS (Generally Recognized As Safe).

Por su parte, el Dulce de Leche (DL) es un producto lácteo muy popular en América Latina, y en particular en la Argentina. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un DL más saludable mediante la incorporación de fibras dietarias prebióticas (inulina y maltodextrina) y L. rhamnosus GG, estudiar la viabilidad del probiótico durante el almacenamiento y su supervivencia en el tracto gastrointestinal, y evaluar el efecto de la presencia de fibras y probióticos sobre la aceptabilidad global del DL.

Materiales y métodos

Materiales

Leche (1% w/v de materia grasa, 80% reducida en lactosa, La Serenísima, Buenos Aires, Argentina), sacarosa (grado alimenticio, Ledesma, Jujuy, Argentina); glucosa (Cicarelli, Santa Fe, Argentina); maltodextrina (Zhucheng Dongxiao Biotechnology Co. Ltd., China), Inulina DP >10 (Beneo™ GR, Orafti Active Food Ingredients, Tienen, Belgium), esencia artificial de vainilla (Don Ubaldo, Bahía Blanca, Argentina), bicarbonato de Sodio (grado alimenticio, Eti Soda, Ankara, Turquía). Las cantidades de cada ingrediente utilizado fueron, para las muestras sin fibra: 2 litros de leche (aprox. 2066 g), 264 g de sacarosa, 176 g de glucosa, 3 g de bicarbonato de sodio y 2 g de esencia de vainilla. El rendimiento total de DL fue de 457 ± 20 g por litro de leche. En las muestras con fibra se incorporaron 27,4 g de una mezcla de inulina (I) y maltodextrina (M) en partes iguales (1:1), para alcanzar los 3 g de fibra por cada 100 g de producto final, y que de esta manera el DL obtenido pueda ser declarado “fuente de fibra” según el CAA. Para las muestras con probióticos, los mismos se agregaron como se detalla en la Sección 2.2.4. Se obtuvieron cuatro formulaciones diferentes, a saber: DLP-se (DL con probióticos sin encapsular), DLP-e (DL con probióticos encapsulados), DLIMP-se (DL con inulina y maltodextrina y probióticos sin encapsular) y DLIMP-e (DL con inulina y maltodextrina y probióticos encapsulados).

Métodos

Preparación del probiótico. Un cultivo puro de L. rhamnosus GG (ATCC 53103) (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) conservado en freezer a -70ºC se cultivó en caldo MRS a 37ºC durante 24 h. Luego, se transfirió a tubos con 10 ml de caldo MRS incubándose durante 24 h en las mismas condiciones. Las células se colectaron por centrifugación a 2100x g por 10 min y se lavaron dos veces con solución salina estéril (0,9 g NaCl/100ml). Las células probióticas así obtenidas se utilizaron en el proceso de encapsulación, ajustándose la concentración celular a 10^11-12 UFC/ml.

Encapsulación del probiótico. La preparación de las cápsulas se realizó mediante el método de extrusión según se describe en Bepeyeba y col. (2017). Brevemente, las partículas se obtuvieron mezclando la suspensión del probiótico preparada según se detalla en el ítem anterior con una solución estéril de pectina de bajo metoxilo al 2% (p/v). Las partículas se formaron por goteo de una parte de la suspensión en cinco partes de una solución estéril de CaCl2 150 mM utilizando una aguja estéril de 0,4 mm de diámetro externo y 0,2 mm de diámetro interno (27G x ½´´). Las partículas así formadas se colectaron por filtración y se lavaron con agua destilada estéril. Las cápsulas se conservaron a 4 °C en solución salina estéril para los ensayos posteriores.

Determinación de la eficiencia de encapsulación (EE). La evaluación cuantitativa de las células probióticas en las cápsulas se realizó solubilizando las mismas en buffer citrato de sodio 0,1 M pH 6,2 estéril para liberar las células de L. rhamnosus. Para tal fin, 1 g de las cápsulas se suspendió en el buffer y se dejó durante 20 min con agitación constante a 200 rpm para lograr la disolución de la cubierta polimérica. Luego, se realizaron diluciones decimales para el recuento en placa en agar MRS y se incubó a 37ºC durante 72 h. La EE se determinó mediante el siguiente cálculo:

EE% = (Log N/Log N0) x 100

Siendo N el número de células liberadas de las cápsulas y N0 el número de células libres agregadas a la suspensión de pectina.

Elaboración del DL enriquecido con I, M y probióticos. Las muestras de DL se elaboraron de acuerdo a las normas estipuladas por el CAA. En una olla de acero inoxidable y triple fondo (Thomás Rosenthal, Alemania) se colocó la leche fría, junto con el bicarbonato y la sacarosa. Posteriormente se colocó la olla sobre una placa calefactora (Decalab SRL, Buenos Aires, Argentina) y se inició el calentamiento y la agitación mediante un agitador mecánico vertical (DLAB OS40-Pro, Ontario, USA) a 50 rpm. Teniendo en cuenta la práctica industrial (Malec y col., 2005) la glucosa se agregó a los 90 min, continuando con el calentamiento y la agitación hasta que la mezcla alcanzó la concentración deseada de sólidos solubles (69 ± 1 ºBrix) determinada con un refractómetro Abbe WYA (ARCANO, Gea Srl, Santa Fe, Argentina). El tiempo total de cocción fue de 5 horas y 30 minutos. Una vez que se alcanzó la concentración deseada se cortó el calentamiento y se continuó con la agitación para enfriar la preparación. La vainilla se agregó durante la etapa de enfriamiento a 60 ºC para así evitar que la misma se volatilice. Posteriormente, las muestras se envasaron (técnica aséptica) en frascos de vidrio previamente esterilizados y etiquetados (diámetro=65 mm y altura=80 mm), que se sellaron con sus tapas a rosca. Finalmente, luego de que el DL se enfriara por debajo de 40°C, los probióticos fueron inoculados en forma aséptica, utilizando una cabina de flujo laminar (Dauerhaft, Biobase, Biodustry, (Sahndong) CO., LTD). Los probióticos (P) se agregaron en proporción de 1 g de cápsulas por cada 100 g de DL, tal que el producto final contenga un número de células viables comprendido entre 10⁶ y 10⁹ cél/g, de manera que pueda ser rotulado “con probióticos”, según el CAA. Los DL envasados se almacenaron a temperatura de refrigeración (5 ±1 ºC) durante seis meses. Por otro lado, para las muestras enriquecidas con fibra (y probióticos) se siguió un procedimiento similar al descripto anteriormente, sólo que al inicio se separó una pequeña porción de leche (sin bicarbonato, ni sacarosa) para hidratar las fibras antes de agregarlas a la preparación y así evitar la formación de grumos. Las fibras hidratadas se agregaron una hora antes de terminar la preparación.

Viabilidad de las células probióticas en los DL durante el almacenamiento en refrigeración. Quincenalmente, se realizaron los recuentos de células probióticas en los dulces según las condiciones del probiótico agregado: libre o encapsulado. En el primer caso, 5 g de muestra de alimento se diluyó con 45 ml de solución salina estéril. El recuento celular se realizó mediante diluciones decimales en agar MRS a 37°C durante 72 h. En el segundo caso, 5 g de muestra se diluyó en 45 ml de buffer citrato de sodio 0,1M pH 6,2 estéril y se dejó durante 20 min con agitación constante a 200 rpm. El recuento celular se realizó como se detalló para el probiótico libre. Los resultados obtenidos se expresaron como UFC/g de alimento.

Supervivencia de las células probióticas en condiciones de simulación del sistema digestivo. Al final del período de almacenamiento, se evaluó la resistencia del probiótico (libre o encapsulado) incorporado al alimento a las condiciones gastrointestinales simuladas, de acuerdo a lo establecido por Qi y col. (2020). Brevemente, 5 g de alimento se colocaron en tubos conteniendo 5 ml de jugo gástrico simulado (JGS) estéril (NaCl 125 mM, KCl 7mM, NaHCO3 45mM y pepsina 3g /L, pH 2,5 ajustado con HCl 1 N) y se incubaron a 37ºC por 30, 60, 90 y 120 min. Se tomaron muestras en cada tiempo. El recuento celular se realizó como se detalla en el ítem anterior para las muestras con células libres y encapsuladas. A 5 g de cada muestra restante ya expuesta al JGS, se le agregaron 5 ml de jugo intestinal simulado (JIS) estéril (NaCl 22 mM, KCl 3,2 mM, NaHCO3 7,6 mM, pancreatina 0,1% (p/v), 0,15% (p/v) de sales biliares, pH 8,0 ajustado con NaOH 1N) y se incubó a 37ºC por 180 min. En todos los casos, el recuento celular se realizó como se detalló para las muestras expuestas a JGS. Al final de cada paso (JGS y JIS) se calcularon los porcentajes de reducción:

Reducción [%] = [(Log N0-LogNf) / Log N0] x 100

Siendo N0 el recuento celular inicial y Nf el recuento celular final de cada paso.

Análisis sensorial. Se realizó el análisis sensorial de muestras frescas de DL al inicio del almacenamiento (DLP-se, DLP-e, DLIMP-se y DLIMP-e) a fin de determinar el grado de aceptación por parte de los consumidores. Un total de 100 panelistas no entrenados (42 hombres y 58 mujeres) participaron en el estudio, identificados como consumidores habituales de DL. Cada panelista evaluó en una única sesión las cuatro muestras mencionadas, que se presentaron codificadas con un número de tres dígitos y ordenadas de manera aleatoria. Los panelistas recibieron instrucciones de considerar el aspecto, el sabor, la consistencia y la untabilidad de las muestras y, basándose en estos atributos, se les pidió que determinaran la aceptabilidad global de cada muestra en una escala hedónica estructurada de 9 puntos (1 = me disgusta mucho, 5 = me es indiferente y 9 = me gusta mucho).

Análisis estadístico. Los datos experimentales del análisis sensorial fueron analizados mediante un ANOVA doble, tomando como factores la presencia de fibra (dos niveles, con y sin fibra) y el encapsulado de los probióticos (dos niveles, sin encapsular y encapsulados). Además, se aplicó un test de Tukey para comparar las medias con un nivel de significancia de 5%, usando el programa InfoStat v. 2014. Los datos experimentales de los ensayos microbiológicos se calcularon a partir de los datos obtenidos de los recuentos celulares (Log UFC/g). Las diferencias entre las muestras (sin encapsular y encapsuladas) se analizaron mediante un ANOVA, seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey con un nivel de significancia de 5% (SigmaPlot 12).

Resultados y discusión

Viabilidad y supervivencia de L. rhamnosus GG. La eficacia de encapsulación de L. rhamnosus GG con pectina al 2% fue del 83,3%. Los recuentos iniciales fueron cercanos a 10 log UFC/g para el probiótico tanto libre como encapsulado en las distintas muestras. A los seis meses, la viabilidad del probiótico libre en las muestras DLP-se y DLIMP-se fue de 3,4×10⁶ y 1,0×10⁷ UFC/g, respectivamente. En el caso de los probióticos encapsulados, la viabilidad fue de 1,0×10⁷ UFC/g para la muestra DLP-e y de 2,0×10⁷ UFC/g en la muestra DLIMP-e. Conforme a estos resultados, todas las muestras cumplen con los requerimientos mínimos de células viables probióticas por gramo de alimento, según el Art. 1389 del CAA. Luego de la simulación del pasaje por el tracto gastrointestinal, se observaron reducciones en el número de células viables del probiótico en todas las muestras, disminuyendo la viabilidad de Lacticaseibacillus rhamnosus GG hasta 3,0×10⁵, 9,0×10⁵, 1,5×10⁶ y 1,0×10⁷ UFC/g en DLP-se, DLIMP-se, DLP-e y DLIMP-e, respectivamente. Sólo las células encapsuladas presentaron recuentos por encima de 10⁶ UFC/g, la cantidad estimada como mínima para promover los efectos benéficos en el huésped (Nazzaro y col., 2009; Hill y col., 2014), por lo que podemos concluir que la encapsulación con pectina mejora significativamente la viabilidad del probiótico en condiciones gastrointestinales simuladas, en consonancia a lo observado en otros estudios (Khorasani y Shojaosadati, 2017; Dafe y col., 2017).

Análisis sensorial. En la Tabla 1 se presentan las medias obtenidas para la aceptabilidad global de las distintas muestras de DL.

Tabla 1 – Aceptabilidad global del dulce de leche con probióticos (DLP-se y DLP-e) y dulce de leche enriquecido con fibra y probióticos (DLIMP-se y DLIMP-e)

Muestra       Aceptabilidad global

DLP-se               6,91 ± 1,82 ^a

DLP-e                6,66 ± 1,96 ^ab

DLIMP-se          7,08 ± 1,78 ^a

DLIMP-e            6,12 ± 2,01 ^b

*Medias con una letra en común no son significativamente diferentes (p>0,05).

Los valores promedio de aceptabilidad global estuvieron entre 6,12 y 7,08 en la escala hedónica de 9 puntos. Según Meilgaard y col., 2007 y Melese y Keyata., 2022 un puntaje mayor a 5 se puede considerar como nivel aceptable. Tomando este valor de referencia, se calculó el porcentaje de panelistas que consideraban cada muestra como aceptable. El orden de preferencia resultante fue: DLIMP-se (88%) > DLP-se y DLP-e (87%) > DLIMP-e (80%), donde el número entre paréntesis indica el mencionado porcentaje de aceptación. A partir de este resultado, se puede decir que más del 80% de los panelistas consideraron como aceptables a los DL con fibra y probióticos. Por otro lado, el análisis estadístico demostró que la presencia de fibra no tuvo efecto significativo sobre la aceptabilidad, mientras que la encapsulación de los probióticos la redujo, y la interacción de ambos factores no fue significativa.

Conclusiones

La pectina de bajo metoxilo, utilizada como agente encapsulante en este estudio, protegió a L. rhamnosus GG de las condiciones simuladas del sistema gastrointestinal, preservando la viabilidad celular del probiótico encapsulado en la matriz alimentaria en valores significativamente mayores que en el caso del probiótico libre. Por otro lado, los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que fue posible elaborar un DL enriquecido con fibras dietarias y probióticos, que resultó altamente aceptable por parte de los consumidores.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica (PICT 2017 N° 1522).

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