Durante la elaboración de los productos cárnicos crudo-curados fermentados, las etapas de maduración y secado constituyen puntos críticos en lo que refiere a la calidad higiénico-sanitaria de los mismos.
La colonización superficial de estos productos por diferentes cepas fúngicas les otorga características organolépticas específicas, protegiéndolos además de la luz y el oxígeno e inhibiendo el desarrollo de bacterias indeseables.
No obstante, el fuerte componente artesanal y/o las deficiencias inherentes al proceso productivo y la infraestructura, permiten la contaminación con especies potencialmente toxigénicas presentes en el ambiente.
Este trabajo contempló e lrelevamiento de la microflora fúngica estacional (invierno-verano) presente en el sector de los secaderos de dos plantas de chacinados, ubicadas en la ciudad de Santa Fe. Una de éstas realizaba elaboración artesanal y la otra automatizada. Un total de 46 aislamientos de hongos filamentosos provenientes del ambiente, superficies de embutidos e insumos (tripa/CIF), fueron caracterizados macroscópicamente y microscópicamente hasta la identificación de género.
Todos los aislamientos pertenecientes al género Penicillium y Aspergillus(15/46) se caracterizaron a nivel de Serie o Especie siguiendo las claves taxonómicas de Pitt & Hocking.
La capacidad toxigénica de los hongos caracterizados morfológicamente, reportados en la bibliografía comotales (22/46), se evaluó a través del bioensayo deA rtemia salina. Para ello, se emplearon diluciones (1/10, 1/50, 1/100) de los sobrenadantes (SN) provenientes de los cultivos de los hongos tras siete días de crecimiento, en las condiciones específicas del bioensayo, por triplicado.
Un total de diez aislamientos presentaron toxicidad leve (DT) y dos fueron tóxicos (T), mientras que diez resultaron no tóxicos (NT). El test no paramétrico de Kruskal y Wallis determinó la existencia de diferencias significativas (p<0,05) entre el Control y las diluciones de los SN, pero no entre estas últimas.
Teniendo en cuenta los tiempos de residencia de los chacinados en los secaderos (cuatro a siete días según el proceso operativo de las empresas involucradas), la naturaleza de la matriz alimentaria (relación proteína/grasa) y de las sustancias toxicogénicas (migración al interior del embutido), se consideró, para la evaluación del riesgo, la menor dilución de los SN fúngicos.
Estos resultados identificaron a priori el riesgo químico asociado a la presencia de hongos ambientales toxicogénicos y micotoxicogénicos que comprometen la inocuidad alimentaria.
INTRODUCCIÓN
La producción de chacinados y embutidos crudo-curados reviste gran importancia socio-económica en la Argentina debido al elevado consumo per cápita, destacándose numerosas fábricas radicadas en Buenos Aires, Santa Fe y Córdoba, con importantes diferencias en sus sistemas productivos y en la infraestructura de las instalaciones, lo cual impacta en la seguridad alimentaria.
Muchos de estos productos se vinculan a la cultura asociada a su elaboración, origen geográfico y condiciones locales de producción, configurándose como un sistema de calidad diferenciada y agregado de valor, tales como los “Alimentos con Sello Argentino”, “Sistema de Indicación Geográfica y Denominación de Origen”.
Durante el proceso productivo, específicamente durante las etapas de maduración y secado, el crecimiento de hongos y levaduras sobre la tripa juega un rol importante en el desarrollo de las características organolépticas del producto final, protegiéndolo de la luz y el oxígeno e inhibiendo el desarrollo de bacterias indeseables.
Por otra parte, los hongos asociados alemplume de embutidos crudo-curados involucran especies de Penicillium, tales como P.nalgiovense, P. olsonii, P. chrysogenum, P. verruco-sum, P. spathulatum, P.solitum, P. oxalicum, P.commune, P. camemberti, P. expansum, P. miczynskii y P. simplicissimum17;18; 27; 9; 1.
Se asocian, además, especies contaminantes como P. aurantiogriseum19y de los géneros Aspergillus, Scopulariopsis, Rhizopus, Eurotium, Cladosporium y Mucor5los cuales, en función de la actividad acuosa (aw), alteran la calidad sensorial del producto. Existen numerosos trabajos que reportan la producción de compuestos toxicogénicos y micotoxigénicos en productos cárnicos crudo-curados secos y semisecos26; 22; 18; 15; 3; 4; 12; 7; 24.Peromingoet al. (2019) demostraron la difusión de metabolitos secundarios, ocratoxina A (OTA) y ácido ciclopiazóni-co (CPA), al inocular salchichas fermentadas y jamón crudo con P. nordicum, P.verrucosum y P. griseoful-vum, simulando el proceso de maduración industrial.
Los metabolitos secundarios difundían desde la superficie, contaminando los productos hasta los 3 cm de profundidad, siendo mayor en las salchichas fermentadas respecto del jamón crudo.
Aunque los niveles detectados de compuestos tóxicos de origen fúngico han sido pequeños y limitados a no más de unos pocos milímetros bajo la superficie del embutido o chacinado, el crecimiento de mohos no deseables debería evitarse, no sólo por el riesgo de formación de micotoxinas y antibióticos, sino también por los defectos que provocan sobre la calidad sensorial del producto.
Resulta común, entre los fabricantes de chacinados, cepillar o lavar el producto previo a su expedición, espolvoreándolos con fécula o envasándolos al vacío. No obstante, la remoción de lmicelio fúngico no asegura un alimento inocuo desde el punto de vista toxicológico, ya que podría haber difusión previa de metabolitos secundarios al interior del producto.
Así, la práctica de remover la superficie enmohecida de estos productos cárnicos no elimina el riesgo16;20. Por otra parte, el uso de starters comerciales (CIF) compuestos por hongos no micotoxigénicos y no productores de antibióticos, adaptados al proceso de maduración, permite controlar poblaciones microbianas indeseables a la vez que estandariza la producción13; 23; 28.
De esta manera, la clave radica en dirigir la ecología microbiana del producto durante las etapas de maduración y secado para asegurar la inocuidad y calidad sensorial2. No obstante, resulta necesario tener un estricto control del ambiente de producción y de mantenimiento preventivo delas instalaciones6.No existen criterios establecidos en la legislación actual respecto de las especies fúngicas “permitidas” a nivel de la superficie de embutidos crudo-curados secos, aunque se ha demostrado que muchos de los incluidos en los CIF son potencialmente toxicogénicos.
Hasta el momento, Italia es el único país que ha adoptado lineamientos más estrictos para la presencia de OTA en productos cárnicos (OTA < 1μg/kg), teniendo en cuenta el elevado consumo per cápita y el posible impacto en la Salud Pública de no establecerse esta medida.
Por otra parte, si bien el reglamento europeo (CE No 1881/2006) establece límites máximos de ciertas micotoxinas en diferentes categorías de alimentos, no incluye a los productos cárnicos fermentados.
Nuestra legislación alimentaria (CAA) tampoco establece (o recomienda) criterios en referencia a las especies fúngicas permitidas en la superficie de estos productos cárnicos. Teniendo en cuenta que el consumo per cápita de estos productos ha aumentado notablemente en los últimos años y que cada vez son más las reacciones alérgicas ante el consumo de ciertos alimentos, resulta de interés evaluar el riesgo de la presencia de hongos toxicogénicos en el ámbito industrial.
El presente trabajo de investigación planteócaracterizar los hongos filamentosos presentes en el ambiente de los secaderos de dos fábricas de chacinados de la ciudad de Santa Fe, determinando su capacidad toxicogénica, a fin de evaluar el riesgo químico presente en embutidos crudo-curados secos y semisecos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de hongos en el ambiente productivo Se realizó un muestreo estacional (invierno-verano) en el sector de los secaderos de dos fábricas de chacinados de Santa Fe, una de elaboración artesanal (sin CIF y tripa natural, empresa B) y otra automatizada (con CIF y tripaartificial, empresa A).
Los productos se seleccionaron en función del nivel de producción y la contaminación observada al momento del muestreo. Para ello se realizó un hisopado 14de la superficie de los productos en proceso, seleccionando aquellos que presentaban manchas negras, amarillas, naranjas y verdes.
Las muestras se conservaron y trasladaron en tubos cerrados consolución fisiológica estéril bajo condiciones de refrigeración. Las muestras se sembraron en estría, utilizando Agar Extracto de Malta (AEM) a 25°C, 7-10 días en condiciones de aerobiosis. Las colonias macroscópicamente diferentes se repicaron al mismo medio por siembra puntual hasta la obtención de cultivos axénicos, asignando a cada aislamiento un código que permitió correlacionar la fecha de muestreo, tipo y lote del producto y la empresa (trazabilidad del muestreo).
El aislamiento de hongos del ambiente de los secaderos se realizó por exposición de placas de Petri con AEM durante 15 minutos, altura estándar (1,0-1,5 m del suelo). Culminado el tiempo de exposición, las placas se cerraron y trasladaron al laboratorio incubándolas a 25°C, 7-10 días en aerobiosis.
Cada aislamiento (cultivo axénico) se caracterizó macroscópicamente (observación de la colonia gigante) y microscópicamente mediante la técnica de cinta engomada, fragmento de colonia y/o micro-cultivo. Los aislamientos se sembraron en tubos con AEM (en rampa), conservándolos a 4°C como stock de trabajo.
Además, se conservaron por triplicado en viales a-80°C, en caldo YPG suplementado con 20% de glicerol, como stock permanente.
CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA
Del total de los aislamientos realizados, se seleccionaron aquellos pertenecientes a los géneros reportados como toxicogénicos y micotoxigénicos en la bibliografía: Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Trichoderma. Para la caracterización e identificación morfológica de los aislamientos pertenecientes a los géneros Penicillium y Aspergillus, se realizaron las técnicas clásicas propuestas por Pitt and Hocking (1999). Se utilizaron los medios Agar Czapek con Extracto de Levadura (CYA), Agar Nitrato con 25% de Glicerol (G25N) y Agar Extracto de Malta (AEM). Las placas de Petri con medio MEA y G25N (20 mL/placa) se incubaron a 25°C en aerobiosis, mientras que las que contenían CYA, se incubaron a 5°, 25° y 37°C.
En los casos que se identificó un aislamiento de Penicillium subgénero penicillium se utilizó CSN (CREA modificado), medio que aplica a la identificación de hongos xerófilos a 25°C (21).
Cada aislamiento se sembró de manera puntual en tres puntos equidistantes del borde y centro de la placa de Petri. La lectura se efectuó a los siete días de la siembra, previa calibración del ocularmicro-métrico.
Se determinó así el diámetro de las colonias, apariencia, textura, formación de estrías y surcos superficiales, producción de exudados y pigmentos solubles que difunden al medio de cultivo, coloración del micelio, de los conidios o esporas, así como del reverso de la colonia.
Todos los que presentaron idéntica descripción macroscópica se agruparon para luego ser identificados empleando las claves de referencia. Las colonias obtenidas a 5°C y 37°C se observaron mediante lupa estereoscópica a fin de comprobar si el crecimiento o la germinación estaban presentes.
Las observaciones microscópicas se realizaron a partir de las colonias crecidas en los medios CYA y MEA, mediante las técnicas de fragmento de colonia y/o cinta engomada con azul de lactofenol para evidenciar la textura superficial de las hifas, la presencia de cuerpos de fructificación, su diámetro, forma y arquitectura externa de los conidios y esporas.
En el caso de los aislamientos de Penicillium, se registró el número de ramificaciones de la estructura reproductiva, longitud y textura superficial de los conidióforos, número y longitud de las métulas, fiálides y conidios.
En los aislamientos pertenecientes al género Aspergillus, se evaluó la textura superficial del estipe; longitud de las hifas; número y longitud de las métulas, fiálides y diámetro de los conidios; color y diámetro de cleistotecios; textura, forma y diámetro de las cabezas conidiales; textura y forma de las ascosporas.
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD
La capacidad toxicogénica se determinó a través del bioensayo con larvas de Artemia salina(11; 10;8). Los huevos deA. salina se reactivaron (40 mg en 100 mL) en una solución de sal marina (2,4%m/v) estéril, incubando a 25°C durante 24 horas, con foto periodo natural (11 horas luz/13 horas oscuridad) y aireación reducida (aproximadamente una burbuja/minuto).
Palabras clave: embutidos crudo-curados, toxicidad fúngica, secadero, inocuidad alimentaria.
Ducret F.G.1, Latorre Rapela M.G.2, Comelli R.3, Benzzo M.T.1
Laboratorio de Ingeniería Ambiental-Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas–UNL.Santa Fe, Argentina. Cátedra de Microbiología General-Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas–UNL. Santa Fe, Argentina.
Departamento de Medio Ambiente. Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas-UNL. SantaFe, Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), mtbenzzo@fich.unl.edu.ar
