David Tomat1*; Cecilia Casabonne1; Virginia Aquili1; Andrea Quiberoni2
1Área de Bacteriología – Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas – Universidad Nacional de Rosario. Rosario, Argentina.
2Instituto de Lactología Industrial (UNL – CONICET) – Facultad de Ingeniería Química. Santa Fe, Argentina.
*dtomat@fbioyf.unr.edu.ar
INTRODUCCIÓN
Las especies de Shigella son patógenos transmitidos por los alimentos y el agua (Maurelli, 2013; Tack y col., 2019) que se han aislado de diferentes alimentos (OMS, 2005), como verduras, carnes, frutas y verduras y productos lácteos (Ahmed y col., 2014; Hsu y col., 2010). Los países en desarrollo presentan una alta incidencia de shigelosis (Zafar et al., 2005), que afecta especialmente a niños menores de cinco años (Havelaar y col., 2015). Específicamente, Shigella flexneri es el patógeno más prevalente responsable de la shigelosis en la Argentina (Torrez Lamberti y col., 2020). Estas bacterias son responsables de brotes de intoxicación alimentaria en todo el mundo (Lee y col., 2016) y son una causa importante de mortalidad infantil en nuestro país (Rubinstein y col., 2018).
El tratamiento de alimentos con aditivos como ácidos orgánicos es un método eficaz para reducir las poblaciones de patógenos (Tetteh y Beuchat, 2003). Sin embargo, Shigella puede sobrevivir durante períodos de tiempo considerables en condiciones como altas concentraciones de ácidos orgánicos (Small y col., 1994; Lin y col., 1995). Asimismo, biocidas como el hipoclorito y el etanol se utilizan comúnmente en la industria alimentaria para descontaminar y desinfectar superficies relacionadas con los alimentos, como equipos y herramientas. Los bacteriófagos son herramientas de biocontrol que pueden utilizarse como una tecnología económica y más natural para mejorar la seguridad alimentaria. A diferencia de los aditivos, los fagos son agentes muy específicos que atacan únicamente a las bacterias objetivo sin afectar las propiedades organolépticas de los alimentos. Por lo tanto, la caracterización tecnológica de fagos activos contra Shigella flexneri en diferentes entornos alimentarios para combatir patógenos transmitidos por los alimentos puede permitirnos seleccionar fagos para tratamientos de biocontrol más eficaces.
En nuestros estudios previos, se aislaron diez fagos líticos contra cepas de S. flexneri y se caracterizaron según su rango de hospedadores, ensayos de desafío, ensayos de adsorción y pruebas de estabilidad bajo diversas condiciones de estrés (Tomat y col., 2022a y 2022b). Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la influencia de los aditivos presentes en alimentos y biocidas presentes en entornos relacionados con alimentos sobre la viabilidad de los fagos. Si bien se han realizado estudios de fagos de Shigella en varios alimentos (Magnone y col., 2013; Soffer y col., 2017; Zhang y col., 2013), no se han documentado aquellos centrados en evaluar la viabilidad de los fagos de S. flexneri enfrentados contra aditivos y biocidas de uso diario.
MATERIALES Y MÉTODOS
Bacterias y fagos
La cepa ATCC12022 de Shigella flexneri (serotipo 2b) se utilizó para propagar (stocks de fagos, gelatina de trismagnesio, TMG, 4 °C) y enumerar (unidad formadora de placa por mililitro; UFP mL-1) fagos en estudios de viabilidad. Los stocks bacterianos (caldo de tripteína de soja, CTS, glicerol al 15 % v/v, -80 °C) se reactivaron (TSB, 37 °C) durante la noche para ensayos de viabilidad con fagos. Diez (10) fagos (AShi, Shi3, Shi22, Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93, Shi113) previamente aislados de 114 muestras de heces (Tomat et al., 2022a) se utilizaron para evaluar su viabilidad frente a diversas concentraciones de diversos biocidas y conservantes.
Viabilidad de los fagos frente a aditivos alimentarios
Se evaluó la viabilidad de diez fagos de Shigella frente a conservantes de grado alimentario. Las suspensiones de fagos (buffer TMG con 105-106 UFPmL-1) se expusieron a ácidos orgánicos débiles y sus sales. Los ensayos se realizaron a 25 °C con un volumen final de 1 mL. Tratamientos (concentración del conservante; tiempo de incubación): Ácido acético: 2 % y 4 %; 5 min, 15 min, 30 min, 60 min y 24 h. Ácidos láctico y cítrico: 2 % y 4 %; 5 min, 15 min, 30min y 60 min. Acetato (sodio), lactato (sodio) y citrato (sodio): 2 % y 4 %; 60 min, 120 min y 24 h. Benzoato (sodio): 0,1 %; 60 min, 120 min y 24 h. Sorbato (potasio): 0,3 %; 60 min, 120 min y 24 h. Propionato (sodio): 0,32 %; 60 min, 120 min y 24 h.
Las concentraciones utilizadas corresponden a las máximas permitidas (o inferiores) para cada conservante en alimentos (Código Alimentario Argentino). Tras la incubación con cada conservante, se realizó el recuento de fagos mediante el método de titulación en placa de doble capa (Tomat y col., 2013). Los resultados se expresaron como UFPmL-1. Los controles se realizaron en agua destilada estéril sin conservantes.
Viabilidad de los fagos frente a los aditivos en una matriz alimentaria
Para evaluar la viabilidad de los fagos frente a los conservantes alimentarios en una matriz alimentaria, se cortaron asépticamente trozos de carne (1 cm2; pH 5,7), se colocaron en placas de Petri y se preequilibraron a 25°C. A continuación, se pipetearon 20 µL de cada fago (~105–106 UFP mL-1) y 20µL de cada ácido orgánico (4%) (acético, láctico y cítrico) sobre la superficie de la muestra de carne y se dejaron secar (10 min a 25 °C) tras la adición de cada volumen. Para alcanzar el 100 % de viabilidad de los fagos, las muestras con fagos también se inocularon con 20 µL de tampón TMG en lugar de los ácidos orgánicos. Los controles y los tratamientos se incubaron a 25 °C. Tras cada periodo de incubación (30 min, 60 min), los trozos de carne se transfirieron a una bolsa estéril, se añadió 1 ml de tampón TMG y las muestras se procesaron durante 2 min en un Stomacher (Seward, Londres, Reino Unido). A continuación, todo el líquido del Stomacher (1 ml) se transfirió a un tubo Eppendorf estéril, se centrifugó (3000 rpm, 10 min) y se sembraron 0,1 ml del sobrenadante para la enumeración de fagos, como se describió previamente (Tomat y col., 2013).
Viabilidad de fagos frente a biocidas
También se realizaron estudios de viabilidad de fagos frente a diversas concentraciones de diferentes biocidas. Se incubaron suspensiones de fagos en buffer TMG con un contenido de ~105–106 UFP mL-1 con soluciones biocidas. Todos los biocidas se diluyeron con agua destilada estéril. Los ensayos se realizaron a 25 °C con un volumen final de 1 mL. Tratamientos (concentración de biocida; tiempo de incubación): hipoclorito de sodio (50ppm, 100 ppm y 500 ppm; 1 min y 10 min). Etanol: (10 %, 70 % y 96%; 15 min, 30 min, 60 min y 24 h). Cloruro de amonio cuaternario (CAC): (2 %, 3 % y 4 %; 15 min, 30 min, 60 min y 24 h). Peróxido de hidrógeno (H2O2): (2%, 3 % y 4 %; 15 min, 30 min y 60 min). Tras cada tiempo de incubación, se enumeraron los fagos (Tomat y col., 2013). Las placas (agar tripteína soja, ATS, 1,5 %) se incubaron durante 18 h a 37 °C y se contaron las UFP para evaluar la viabilidad de cada fago. Los fagos incubados en agua destilada estéril sin biocidas se utilizaron como control.
Análisis estadístico
Se compararon las medias de dos muestras (tratamiento y control) mediante la prueba t de Student con un valor de p < 0,05, con n = 3 observaciones (tres experimentos independientes) en cada grupo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Viabilidad de los fagos frente a aditivos alimentarios
Para determinar si los diez fagos de Shigella en estudio pueden soportar las condiciones presentes en una matriz alimentaria y ser útiles como herramienta de biocontrol, se evaluó su viabilidad frente a diferentes conservantes. El efecto del ácido acético en la viabilidad de los fagos se muestra en la Figura 1. Tres fagos, AShi, Shi3 y Shi22, mostraron una alta resistencia a este conservante, ya que sus viabilidades se vieron ligeramente afectadas solo a la concentración más alta (4%) analizada tras largos periodos de incubación (30 y 60 min). AShi fue el único fago detectado (70 UFP mL-1) tras 24 h de incubación a la concentración más baja (2%) analizada (datos no mostrados). Con respecto a los otros siete fagos, Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93 y Shi113, se observó una disminución significativa en UFP mL-1 a baja concentración (2%) de ácido acético después de 30 y 60 min de incubación, aunque un número significativo de partículas de fagos (102 – 103 UFP mL-1) permanecieron viables. De acuerdo con nuestros resultados, Lee y colaboradores encontraron que el fago HY01 activo contra S. flexneri resultó altamente resistente a condiciones ácidas (Lee y col., 2016), lo que sugiere que este fago es adecuado para aplicaciones alimentarias. Además, a alta concentración de ácido acético (4%), los fagos (103 – 104 UFP mL-1) resistieron hasta 15 min de incubación y se produjo una inactivación completa después de tiempos de incubación más largos. No se detectó viabilidad cuando estos siete fagos se evaluaron después de un período de incubación de 24 h.
La Figura 2 muestra la viabilidad de los fagos evaluados frente a dos concentraciones (2 y 4%) de ácido láctico. AShi y Shi3 demostraron ser los fagos más resistentes a este ácido orgánico débil en particular. Aunque se observó una disminución significativa para estos dos fagos al 2% de ácido láctico, se detectaron 102 (UFP mL-1; Shi3) y 104 (UFP mL-1; AShi) partículas al final de los experimentos (60 min). Además, a alta concentración de ácido láctico (4%), la inactivación completa se produjo solo después de 30 min de incubación. Los ocho fagos restantes (Shi22, Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93, Shi113) resultaron ser significativamente más sensibles que AShi y Shi3. En concreto, se detectaron partículas de los fagos Shi33, Shi88 y Shi93 tras una incubación de 5 min, tras lo cual se observó una inactivación completa a ambas concentraciones analizadas. En cambio, para los fagos Shi22, Shi30, Shi34, Shi40 y Shi113, sólo se detectaron partículas tras un tiempo de incubación más prolongado (15 min) a la concentración baja (2 %). Otros autores han observado que los fagos de Salmonella enteritidis pueden aumentar su tolerancia al ácido tras un estrés previo (Humphrey y col., 1993), por lo que se requieren más estudios para evaluar si es posible mejorar la resistencia de los ocho fagos.
En cuanto a la viabilidad frente al ácido cítrico, todos los fagos evaluados mostraron una resistencia moderada al 2% de este conservante, ya que 10-2 UFP mL-1 o más partículas permanecieron viables hasta 30 min de incubación (Figura 3). Al 4%, se detectó un número significativo de partículas tras 30 min (AShi y Shi3), 15 min (Shi22) y 5 min (Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93, Shi113) de incubación. Sin embargo, tiempos de incubación más prolongados resultaron en la inactivación completa de todos los fagos analizados.
En resumen, cuando comparamos los tres tratamientos diferentes, concretamente el ácido acético (Figura 1), el láctico (Figura 2) y el cítrico (Figura 3), el ácido más eficaz para inactivar los fagos fue el láctico, seguido en eficacia por el cítrico. Por lo tanto, los fagos de Shigella evaluados podrían emplearse en combinación con conservantes químicos como se sugiere contra otros patógenos como Listeria (Zhang y col., 2013) y Escherichia coli (Tomat y col., 2018).
Finalmente, el ácido acético fue el tratamiento más amigable con los fagos evaluados. Además, también se evaluaron conservantes como acetato (sodio), lactato (sodio), citrato (sodio), benzoato (sodio), sorbato (potasio) y propionato (sodio) y no se observaron diferencias significativas en la viabilidad de los diez fagos probados con respecto a las condiciones de control (datos no mostrados).
Viabilidad de los fagos frente a los aditivos en los alimentos
A continuación, para evaluar si nuestros fagos pueden resistir la acción de ácidos orgánicos en una matriz alimentaria, se evaluó su viabilidad en carne frente a conservantes previamente ensayados (Figura 4). Como ya se sabe, las células de Shigella pueden aumentar su tolerancia al ácido cuando se exponen previamente a ambientes ácidos (Gorden y Small, 1993; Small y col., 1994), por lo que es necesario encontrar fagos resistentes a ácidos orgánicos y condiciones ácidas. Cuando los fagos se desafiaron con ácido acético, AShi, Shi3 y Shi22 no se vieron afectados, ya que sus viabilidades no se redujeron significativamente en ambos tiempos de incubación evaluados. Se observó un comportamiento similar para los fagos restantes sólo después de 30 min de incubación, donde el recuento de fagos se mantuvo en el mismo orden de magnitud que los controles. Por otro lado, cuando se evaluó la viabilidad de estos fagos (Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93 y Shi113) después de 60 min, se observó una reducción significativa (2 log10 UFC mL-1) para todos ellos, sin embargo, aún se pudo detectar una cantidad significativa de partículas (103-104 UFC mL-1).
El ácido láctico produjo una reducción significativa en la viabilidad de los fagos tras 30 min de incubación, aunque la mitad de las partículas (103 104 UFP mL-1) permanecieron viables para cada fago evaluado. Tras una incubación de 60 min, solo se detectaron AShi y Shi3 (102-103 UFP mL-1), ya que los otros ocho fagos estaban completamente inactivados. Asimismo, el ácido cítrico tuvo un efecto similar en la viabilidad de los fagos que el ácido láctico. Es decir, AShi y Shi3 fueron los fagos más resistentes a ambos ácidos orgánicos. Los tratamientos con ácido cítrico al 4% resultaron en la detección de ~103 UFP mL-1 (30 min) y ~102 UFP mL 1 (60 min) de estos dos fagos. En cuanto a los otros virus (Shi22, Shi30, Shi33, Shi34, Shi40, Shi88, Shi93 y Shi113), ~102 UFP mL-1 de partículas sobrevivieron sólo después de un período de incubación de 30 min, mientras que después de 60 min todos ellos estaban completamente inactivados. Aunque se realizaron varios estudios de biocontrol con fagos de Shigella en diferentes matrices alimentarias (Zhang y col., 2013; Soffer y col., 2017; Shahin y col., 2021), no se encontraron ensayos en los que los fagos se enfrentaran contra aditivos de grado alimenticio. Al comparar la influencia de los tres ácidos débiles en la solución (Figuras 1, 2 y 3) con la matriz alimentaria al 4% (Figura 4), los fagos parecieron verse significativamente más afectados por los ácidos en la solución que por el mismo ácido en la matriz de la carne. Esto puede deberse a que los valores de pH de los ácidos orgánicos en solución (pH ~ 2,20a 2,72) son inferiores a los valores de pH alcanzados en la superficie de la carne (pH ~ 4,5 a 5,0) tras la aplicación de ácido (Tomat y col., 2016). Nuestros resultados previos indicaron que la viabilidad de los fagos no se vio afectada significativamente entre pH 5 y pH 11; sin embargo, a pH 3, se observó una reducción significativa de la viabilidad (Tomat y col., 2022a). Además, al comparar la viabilidad entre los tratamientos con los diferentes ácidos orgánicos evaluados, los resultados indicaron que los fagos fueron altamente resistentes al ácido acético (pKa = 4,7) e igualmente resistentes a los ácidos láctico (pKa = 3,8) y cítrico (pKa = 3,1). Solo AShi y Shi3 mostraron una resistencia diferencial a los ácidos láctico y cítrico (Figura 4). De forma similar, otros autores hallaron que un cóctel de fagos fue eficaz para eliminar células de S. flexneri de diversos alimentos (Magnone y col., 2013). Sin embargo, estos fagos no fueron enfrentados contra aditivos alimentarios.
Viabilidad de los fagos frente a biocidas
Los fagos se pueden utilizar en diversas aplicaciones, como la descontaminación de superficies y equipos de procesamiento de alimentos. Los desinfectantes químicos de uso común son capaces de inactivar fagos (Sukumaran y col., 2015). Por lo tanto, los virus utilizados en la industria alimentaria deben evaluar se exhaustivamente para determinar si pueden soportar las condiciones que se encuentran en los entornos alimentarios. La Figura 5 muestra la viabilidad de los fagos de Shigella frente a varias concentraciones de hipoclorito de sodio. Seis (AShi, Shi3, Shi22, Shi30, Shi33 y Shi88) de los diez fagos analizados mostraron una alta resistencia a este biocida, ya que resistieron a concentraciones de hasta 100 ppm durante 10 min. Además, se detectaron partículas de AShi (102 UFP mL-1) y Shi22 (101 UFP mL-1) a la concentración más alta de hipoclorito ensayada después de 1 min de incubación. Por otro lado, Shi34, Shi40, Shi93 y Shi113 fueron los más sensibles a este biocida. Su viabilidad se vio significativamente afectada tras el periodo de incubación más corto (1 min) a la concentración más baja evaluada (50 ppm), y se inactivaron casi por completo (101 UFP mL-1) tras 1 min a 100 ppm.
A continuación, se evaluó la viabilidad de los fagos frente al etanol (Figura 6). Al 10 % de etanol, los fagos demostraron ser altamente resistentes ya que no se observó una reducción significativa en los recuentos de UFP mL-1. A una mayor concentración de etanol (70%), los fagos más resistentes fueron AShi, Shi40, Shi93 y Shi33. Es decir, las partículas de AShi, Shi40 y Shi93 se detectaron después de 30 min, sin embargo, después de 60 min de incubación estos fagos se inactivaron completamente. Por el contrario, el fago Shi33 mostró la mayor resistencia contra este biocida en particular, ya que un gran número de partículas (103 UFP mL-1) permanecieron viables hasta los 60 min. El resto de los fagos probados (Shi3, Shi22, Shi30, Shi34, Shi88 y Shi113) mostraron una alta sensibilidad a este biocida y sólo se detectaron partículas de 103 UFP mL-1 después de 15 min. Con tiempos de incubación más largos, todos resultaron completamente inactivados.
Además, con la concentración más alta de etanol (96%), los diez fagos se inactivaron completamente en 15 minutos, como también se observó tras 24 horas de incubación con 10 y 70% de etanol (datos no mostrados). En consecuencia, la aplicación simultánea de bacteriófagos activos contra Salmonella spp. y conservantes químicos (biocidas) resultó en la inactivación de los fagos (Rodríguez y col., 2004).
Todos los fagos de Shigella mostraron una alta resistencia al CAC (Figura 7). La viabilidad de los diez fagos no se vio afectada al 2% después de un período de 30 min. Esto también fue cierto sólo para Shi22 después de 60 min; para los otros nueve fagos, se observaron reducciones significativas después del mismo período de tiempo (60 min). Al 3% de CAC, ~ 103–104 UFP mL-1 permanecieron viables para la mayoría de los fagos evaluados dentro de los 15 min. A medida que aumenta el tiempo de exposición, los recuentos de fagos disminuyeron hasta 101 (Shi33, Shi34, Shi88), 102 (Shi40, Shi93, Shi113) y 103 (AShi, Shi3, Shi22, Shi30) PFU mL-1, un nivel aceptable de supervivencia de los fagos cuando se expusieron a biocidas. El CAC a una concentración del 4% redujo los recuentos de fagos por debajo del límite de detección en 15 minutos, como también se observó en el último momento de incubación (24 h) para todas las concentraciones de CAC analizadas (datos no mostrados).
La Figura 8 muestra la viabilidad de los fagos de Shigella frente a diversas concentraciones de peróxido de hidrógeno. Se observó un comportamiento similar en la mayoría de los virus evaluados al ser expuestos a H2O2. A la concentración del 2%, las reducciones oscilaron entre 1 y 4 log10 UFP, mientras que 104-105 y 101-102 partículas permanecieron viables tras 30 y 60 min, respectivamente. Al 3%, se observó una mayor reducción de la viabilidad en los diez fagos; sin embargo, los recuentos sólo descendieron de ~104 UFP mL-1 (15 min) a 101-102 UFP mL-1 tras una exposición de 30 min. Tras 60 min, se logró la inactivación completa del fago, ya que no se detectaron partículas viables. El fago Shi93 demostró la mayor sensibilidad a este biocida. Sólo se detectaron 103 y 102 partículas tras 15 min frente al 2% y el 3% de H2O2, respectivamente, mientras que con tiempos de exposición más prolongados se observó una inactivación completa. Al 4%, la inactivación completa de los fagos de Shigella se produjo en los 15 min de incubación. Si bien varios autores encontraron una resistencia variable entre otros fagos al tratarlos con diferentes biocidas (Mercanti y col., 2012; Tomat y col., 2017), nunca antes se había probado la viabilidad de los fagos de S. flexneri frente a los biocidas evaluados en este trabajo.
Los hallazgos presentados en este trabajo demostraron que el uso de fagos y diferentes biocidas contra cepas de Shigella en aplicaciones alimentarias es compatible con diversas concentraciones de biocida y tiempos de exposición. En concreto, los fagos de Shigella analizados pueden utilizarse en combinación con 50 y 100 ppm (1 min) de hipoclorito de sodio, 10 y 70 % (15, 30 y 60 min) de etanol, y 2 y 3 % (15, 30 y 60 min) de CAC y H2O2.
CONCLUSIONES
El presente estudio demuestra que al menos 103 UFP del número inicial de fagos sobreviven en presencia de aditivos aplicados en alimentos. Además, el nivel de fagos que sobrevivieron fue mayor en la matriz alimentaria, lo que sugiere que pueden utilizarse en combinación con los aditivos evaluados como un obstáculo adicional para mejorar la inocuidad alimentaria. Por otro lado, los resultados indican que estos fagos fueron altamente compatibles con los biocidas evaluados. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que evalúa la viabilidad de fagos activos contra S. flexneri en las condiciones descritas. Además, nunca antes se habían realizado ensayos con fagos en alimentos contra cepas de S. flexneri circulantes en nuestra región.
BIBLIOGRAFÍA
Ahmed, A.M., Shimamoto, T. (2014). Isolation and molecular characterization of Salmonella enterica, Escherichiacoli O157:H7 and Shigella spp. from meat and dairy products in Egypt. International Journal of Food Microbiology, 168, 57–62.
Gorden, J., & Small, P.L.C., (1993). Acid resistance in enteric bacteria. Infection and Immunity, 61, 364–367.
Havelaar, A.H., Kirk, M.D., Torgerson, P.R., Gibb, H.J., Hald, T., Lake, R.J., Praet, N., Bellinger, D.C., de Silva, N.R., Gargouri, N., Speybroeck, N., Cawthorne, A., Mathers, C., Stein, C., Angulo, F.J., Devleesschauwer, B. (2015). World Health Organization global estimates and regional comparisons of the burden of foodborne disease in 2010. LoS Med, 12, e1001923.
Humphrey, T.J., Richardson, N.P., Statton, K.M., Rowbury, R.J. (1993). Effects of temperature shift onacid and heat tolerance in Salmonella enteritidis phage type 4. Applied and Environmental Microbiology, 59, 3120–3122.
Hsu, B.-M., Wu, S.-F., Huang, S.-W., Tseng, Y.-J., Ji, D.-D., Chen, J.-S., Shih, F.-C. (2010). Differentiation and identification of Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli in environmental waters by a molecular method and biochemical test. Water Research, 44 (3), 949–955.
Jun, J.W., Giri, S.S., Kim, H.J, Yun, S.K., Chi, C., ChaiJ.C., Lee, B.C., Park, S.C. (2016). Bacteriophage application to control the contaminated water with Shigella. Scientific Reports, 6, 22636.
Lee, H., Ku, H-J, Lee, D-H, Kim, Y-T, Shin, H, Ryu, S, Lee, J-H. (2016). Characterization and genomic study of the novel bacteriophage HY01 infecting both Escherichia coli O157:H7 and Shigella flexneri: Potential as a biocontrol agent in food. PLoS ONE, 11 (12): e0168985.
Lin, J., Lee, I., Frey, J., Slonczewski, J.L., Foster, J.W. (1995). Comparative analysis of extreme acid survival in Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, and Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 177, 4097–4104.
Magnone, J.P., Marek, P.J., Sulakvelidze, A., Senecal, A.G. (2013). Additive approach for inactivation of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella spp. on contaminated fresh fruits and vegetables using bacteriophage cocktail and produce wash. Journal of Food Protection, 76, 1336-1341.
Maurelli, A. T. (2013). Chapter 7 – Shigella and enteroinvasive Escherichia coli: Paradigms for pathogen evolution and host parasite interactions. In M. S. Donnenberg (Ed.), Escherichia coli (2nd ed., pp. 215–245). Boston: Academic Press.
Mercanti, D. J., Guglielmotti, D. M., Patrignani, F., Reinheimer, J. A., Quiberoni, A. (2012). Resistance of two temperate Lactobacillus paracasei bacteriophages to high pressure homogenization, thermal treatments and chemical biocides of industrial application. Food Microbiology, 29, 99e104.
Rodriguez, E., Seguer, J., Rocabayera, X., Manresa, A. (2004). Cellular effects of monohydrochloride of L-arginine, Nα-lauroylethylester (LAE) on exposure to Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus. Journal of Applied Microbiology, 96, 903
Rubinstein, A., Aruachan, D., Burgos, M., Angeleri, P.I. (2018). Direccion Nacional de Epidemiologia y Analisis de la Situacion de Salud Ministerio de Salud de la Nacion Argentina. Boletın Integrado de Vigilancia, 1-90.
Shahin, K., Zhang, L., Soleimani Delfan, A., Komijani, M., Hedayatkhah, A., Bao, H., Barazandeh, M., Mansoorianfar, M., Pang, M., He, T., Bouzari, M., Wang, R. (2021). Effective control of Shigella contamination in different foods using a novel sixphage cocktail. LWT – Food Science and Technology, 144, 111137.
Small, P., Blankenhorn, D., Welty, D., Zinser, E., Slonczewski, J.L. (1994). Acid and base resistance in Escherichia coli and Shigella flexneri: role of rpoS and growth pH. Journal of Bacteriology, 176, 1729–1737.
Soffer N., Woolston, J., Li, M., Das, C., Sulakvelidze, A. (2017). Bacteriophage preparation lytic for Shigella significantly reduces Shigella sonnei contamination in various foods. PLoS One, 12, e0175256.
Sukumaran, A.T., Nannapaneni, R., Kiess, A., Sharma, C.S. (2015). Reduction of Salmonella on chicken meat and chicken skin by combined or sequential application of lytic bacteriophage with chemical antimicrobials. International Journal of Food Microbiology, 207, 8-15.
Tack, D.M., Marder, E.P., Griffin, P.M., Cieslak, P.R., Dunn, J., Hurd, S., Scallan, E., Lathrop, S., Alison Muse, M., Ryan, P., Smith, K., Tobin-D’Angelo, M., Vugia, D., Holt, K.G., Wolpert, B.J., Tauxe, R., Geissler, A.L. (2019). Preliminary incidence and trends of infections with pathogens transmitted commonly through food – foodborne diseases active Surveillance network, 10 U.S. sites, 2015–2018. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report, 68, 369-372.
Tetteh, G.L., Beuchat, L.R. (2003) Exposure of Shigella flexneri to acid stress and heat shock enhances acid tolerance. Food Microbiology, 20, 179–185.
Tomat, D., Mercanti, D., Balague, C., Quiberoni, A. (2013). Phage biocontrol of enteropathogenic and Shiga toxin-producing Escherichia coli during milk fermentation. Letters in Applied Microbiology, 57, 3-10.
Tomat, D., Balague, C., Casabonne, C., Verdini, R., Quiberoni, A. (2016). Resistance of foodborne pathogen coliphages to additives applied in food manufacture. LWT – Food Science and Technology, 67, 50-54.
Tomat, D., Balague, C., Aquili, V., Verdini, R., Quiberoni, A. (2017). Resistance of phages lytic to pathogenic Escherichia coli to sanitisers used by the food industry and in home settings. International Journal of Food Science and Technology, 53 (2), 533-540.
Tomat, D., Casabonne, C., Aquili, V., Balague, C., Quiberoni, A. (2018). Evaluation of a novel cocktail of six lytic bacteriophages against Shiga toxin producing Escherichia coli in broth, milk and meat. Food Microbiology, 76, 434–442.
Tomat, D., Gonzales, A., Aquili, V., Casabonne, C., Quiberoni, A. (2022a). Characterization of ten newly isolated phages against the foodborne pathogen Shigella flexneri. Journal of Food Processing and Preservation, 46 (6), e15676.
Tomat, D., Aquili, V., Casabonne, C., Quiberoni, A. (2022b). Influence of physicochemical factors on adsorption of ten Shigella flexneri phages. Viruses, 14, 2815.
Torrez Lamberti, M.F., Lopez, F.E., Valdez, P., Bianchi, A., Barrionuevo Medina, E., Pescaretti, M.L.M., Delgado, M.A. (2020). Epidemiological study of prevalent pathogens in the Northwest region of Argentina (NWA). PLoS One, 15 (10), e0240404.
World Health Organization. (2005). Guidelines for the control of shigellosis, including epidemics due to Shigella dysenteriae type WHO Document Production Services, Geneva.
Zafar, A., Sabir, N., Bhutta, Z.A. (2005). Frequency of isolation of Shigella serogroups/serotypes and their antimicrobial susceptibility pattern in children from slum areas in Karachi. Journal of Pakistan Medical Association, 55, 184–188.
Zhang, H., Wang, R., Bao, H.D. (2013). Phage inactivation of foodborne Shigella on ready-to-eat spiced chicken. Poultry Science, 92, 211-217.
